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      客戶文章|1區,m5C RNA甲基化測序&5mC DNA甲基化測序助力番茄果實成熟機制研究
      日期:2022年11月16日    來源:
      成熟是果實美味的最后一個不可逆的發育階段,能促進果實傳播,但是果實成熟的調控機制還未完全闡明。2022年8月25日,云序客戶北京農林科學院左進華課題組在the plant journal雜志上發表了文章“DNA and coding/non-coding RNA methylation analysis provide insights into tomato fruit ripening”。該研究通過對不同成熟階段的番茄果實甲基化程度進行比較,在轉錄和表觀遺傳水平上探討了肉質果實成熟過程中的調控關系,并構建了協調調控網絡模型。云序生物有幸參與了此項研究中的m5C merip seq、5mC medip seq、全轉錄組測序等高通量技術服務。
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      發表期刊:the plant journal
      影響因子:7.091
      發表時間:2022年8月25日
      研究方法:m5C merip seq、5mC medip seq、全轉錄組測序
      文章鏈接:DNA and coding/non-coding RNA methylation analysis provide insights into tomato fruit ripening


      云序生物提供的服務:

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      技術路線


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      研究內容

      1.Alisa Craig(AC)番茄果實成熟過程中的多組學特征分析
      全轉錄組測序結果發現番茄果實中有2851個基因存在差異表達。其中1148個基因表達上調,1703個基因表達下調。由于DNA甲基化狀態是番茄果實成熟調控的一個指標,隨后,作者利用5mC medip seq檢測了在發育過程中與番茄成熟基因相關的DNA(5mC)甲基化的變化,KEGG通路分析顯示,與苯丙氨酸代謝、脂肪酸代謝、苯丙素生物合成和植物激素信號轉導相關的基因被富集(圖1a),GO富集分析發現,所有的差異甲基化基因都在脂質代謝過程中富集,并且在啟動子、上游區域、內含子、外顯子和基因間區域中都能檢測到內部5mC甲基化峰,啟動子上的5mC峰最多。(圖1b)。結果表明,5mC在番茄基因組的所有染色體上廣泛分布,低甲基化區域多于高甲基化區域,果實成熟過程中DNA(5mC)甲基化呈整體減少趨勢(圖1c)。此外,差異甲基化區域(DMRs)和差異表達基因(DEGs)數據的整合揭示了參與植物激素生物合成和信號轉導的基因,如生長素響應蛋白IAA17(IAA17)、aba響應元件結合因子(AREB1)、生長素響應蛋白SAUR50(SAUR50)和gibbberrellin2-雙加氧酶3。
      為了確定m5C峰在番茄中的分布,作者比較了AC-MG和ACBr + 6期的DMRs。m5C merip seq發現番茄中存在m5C峰富集的序列基序,如UGUAC和UUCU,此外,還發現了另外兩個基序GUGGRG和UAUAUG(圖2a-d)。
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      圖1.綠熟期(MG)和紅熟6期(Br + 6)AC番茄DNA上的5mC甲基化檢測

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      圖2.Br + 6與MG的AC中m5C甲基化譜概述


      2、番茄果實成熟過程中的多組學特征分析
      對綠熟期與黃熟期Nr果實的全轉錄組測序分析發現,共有2247個差異表達基因(DEGs),其中858個表達上調,1389個表達下調(圖3a)。并且在Nr果實成熟過程中鑒定出了31個環狀RNA和32個lncRNA的差異表達情況。此外,作者還進行了DNA(5mC)甲基化分析,以深入探究了Nr突變體果實在不同階段的(5mC)水平。在基因組水平上,DMRs在每個染色體上的分布并不均勻;1號染色體甲基化區域最多,6號染色體甲基化區域最少(圖3b),在12條染色體上,共鑒定出1694個上調的DMRs和4190個下調的DMRs(圖3c)。研究結果表明,RNA甲基化(m5C)能功能調控基因的表達,但是m5C與mRNA豐度之間的相關性仍有待進一步探索(圖3d)。此后,為了驗證m5C豐度的差異,作者選擇了參與果實成熟的基因,并驗證了WRKY TFs和MADS-box蛋白EJ2中m5C的豐度變化(圖3e-f)。
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      圖3.Nr基因在DNA(5mC)甲基化和RNA(m5C)甲基化水平上的影響及DE編碼和非編碼基因的表達


      3、AC和Nr果實綠熟期的多組學概況分析
      對AC和Nr果實成熟綠色期的DEG進行比較分析,共發現1981個差異表達基因,其中977個表達上調,1004個表達下調(圖4a-b)。在AC和Nr突變體果實之間共鑒定出100個DMRs,其中許多都參與了果實的成熟過程,并且發現5mC在基因間和上游DNA區域周圍高度富集(圖4c)。此外,KEGG分析表明,甲基化基因富集于萜類主干生物合成、淀粉和蔗糖代謝以及戊糖和葡萄糖醛酸鹽的相互轉化的通路上(圖4d),隨后,作者研究了Nr果實成熟過程中與基因表達相關的乙烯釋放過程中DNA甲基化(5mC)的變化,發現EBF1和ERF6被高甲基化,同時Nr-G和AC-MG的表達表達下調(圖4e)。一些DMRs和DEGs,如a-Man、PG、CESA2、PEI、PE和XTH23也被發現參與了果實的質地調控(圖4f)。
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      圖4.轉錄組的概述,以及DNA甲基化(5mC)和RNA甲基化(m5C)水平


      4、AC與Nr果實成熟期的多組學譜分析
      作者比較了Nr-O和AC-Br + 6果實之間的DEGs,發現了2261個DEGs,其中1190個表達上調,1071個表達下調(圖5a)。共發現21個差異表達(DE)的 lncRNA和33個DE環狀RNA,其中有11個lncRNA和16個環狀RNA顯著上調,而10個lncRNA和17個環狀RNA被下調(圖5a)。DMRs的GO和KEGG通路分析顯示,Nr-O和Nr-G中存在許多與油菜素內酯生物合成、倍半萜生物合成、三萜生物合成、二萜生物合成和類胡蘿卜素生物合成相關的基因。根據MeDIP-seq的結果,這些序列的長度在1000~10000bp之間(圖5b),此外,作者還發現了許多編碼轉錄因子的基因,如bHLH18/74/90/123、MYB13/20/21/36/41S3和WRKY49/72/ 77(圖5c)。
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      圖5 比較Nr-O和AC-Br + 6果實中DNA、mRNA及非編碼RNA的甲基化情況


      5.AC和Nr突變體果實成熟過程的多組學比較分析
      為了確定AC果實和Nr突變體果實成熟過程之間的差異,作者比較了AC-MG與AC- Br + 6和Nr-MG與Nr-O之間的DEGs,共發現63個DEGs,其中14個表達上調,49個表達下調(圖6a)。相比之下,僅Nr突變體的果實中就有86個與成熟相關的基因差異表達,其中33個基因表達上調,53個基因表達下調(圖6b)。隨后,通過比較AC和Nr果實中與細胞壁代謝相關的基因,作者發現這些基因在Nr中的表達倍數變化大于AC果實。并且乙烯合成和信號轉導相關基因的表達量Nr果實大于AC果實。為了進一步探究果實間的成熟過程差異,作者還分析了Nr-O、Nr-G、ACBr + 6和AC-MG組的環狀RNA、lncRNAs及其相應的靶基因。在AC和Nr果實中發現11個lncRNA和10個環狀RNA為差異表達,其中3個lncRNA上調,8個lncRNA下調,6個環狀RNA上調,4個環狀RNA下調,并且在Nr中特異性鑒定出19個lncRNA和22個環狀RNA(圖6f-g)。通過DMRs和DEGs聯合分析結果的維恩圖,顯示了AC-MG和AC-Br + 6與Nr-MG和Nr-O對照組中常見和特異性的甲基化基因,并發現在Nr突變體中表達的特定基因中,96個DEGs表達降低,39個表達增加(圖6h)。
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      圖6.聯合分析Nr-O與Nr-G和AC-Br + 6與AC-MG之間的轉錄組、DNA甲基化(5mC)和RNA甲基化(m5C)水平。


      總  結

      該篇文章聯合m5C merip seq5mC medip seq技術,在轉錄和表觀遺傳水平上探討了肉質果實成熟過程中的調控關系,并構建了協調調控網絡模型(圖7),發現AC和Nr中的DMRs和DEGs協同作用與乙烯釋放、類胡蘿卜素積累和細胞壁代謝有關,從而調節果實成熟。首次揭示了mRNA和ncRNA m5C的表達譜,為今后研究果實的成熟和衰老提供了參考數據。
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      圖7.果實成熟過程中乙烯反應和類胡蘿卜素積累、細胞壁分裂和芳香化合物相關途徑的調控模型。


      云序生物m5C甲基化研究五大模塊


      01 m5C RNA甲基化測序

      m5C RNA甲基化測序(m5C-seq)

      對m5C RNA甲基化,目前最流行的檢測手段為m5C-Seq技術,適用于m5C RNA甲基化譜研究,快速篩選m5C RNA甲基化靶基因。云序可提供mRNA和多種非編碼RNA的m5C測序:

      • m5C 全轉錄組測序(涵蓋mRNA,LncRNA,circRNA)

      • m5C  LncRNA測序(涵蓋LncRNA和mRNA)

      • m5C  Pri-miRNA測序(涵蓋Pri-miRNA和mRNA)

      • m5C  mRNA測序

      02 檢測整體m5C RNA甲基化水平

      LC-MS/MS檢測整體RNA甲基化水平

      精準高效,可以實現一次檢測,9類修飾水平檢測,一步到位。

      03 m5C RNA甲基化上游酶的篩選

      m5C RNA甲基化相關酶PCR芯片

      尋找上游直接調控m5C RNA甲基化的甲基轉移酶。

      04 m5C RNA甲基化靶基因驗證

      meRIP-qPCR

      云序提供各類不同修飾的meRIP-qPCR服務,可針對mRNA,lncRNA,環狀RNA等不同類型的RNA分子進行檢測,低通量驗證RNA修飾靶基因表達水平。

      05 機制互作研究

      5.1 RIP-seq/qPCR

      篩選或驗證RNA修飾直接靶點,研究RNA修飾靶基因的調控機制。

      5.2 RNA pull down -MS/WB

      篩選或驗證目標RNA互作基因或蛋白,研究相應的分子調控機制。

      5.3 雙熒光素酶實驗

      驗證兩基因互作,研究相應的分子調控機制。

      5.4 ChIP-seq

      篩選或驗證目標蛋白與DNA互作,研究相應的分子調控機制。



      云序生物DNA甲基化介紹

      DNA甲基化:DNA甲基化能控制基因表達,因而在動植物的生長發育過程中發揮著關鍵的調控作用,并且與包括癌癥在內的多種人類疾病密切相關,是表觀遺傳學研究的熱點。
      01 MeDIP甲基化測序
      將甲基化DNA免疫共沉淀技術(MeDIP)和高通量測序相結合,能夠幫助客戶快速地獲取全基因組范圍內的DNA甲基化圖譜,并比較不同樣品中的甲基化分布差異。配合強大的生信分析實力,我們提供的不僅是海量的測序數據,而且是根據您的研究目的,有針對性地挖掘提煉出取之即可用的結果及出版級圖片。
      MeDIP優勢:
      1.1 相比于WGBS全基因組檢測,性價比更高!
      1.2實現對甲基化(5mC)和羥甲基化(5hmC)的區分。

      02  ctDNA EM-seq甲基化測序
      針對體液樣品中的 ctDNA 進行優化,云序生物為您帶來一種基于酶學方法的 DNA甲基化測序技術 EM-seq(Enzymatic Methyl-seq)。該方法結合使用多種酶,在保證 5mC 和 5hmC 在 Illumina 測序中仍被識別為 C 的前提條件下,將未發生修飾的胞嘧啶(C)轉化為尿嘧啶(U),并在后續的擴增和測序過程中被識別為胸腺嘧啶(T)。EM-seq 有效彌補了全基因組重亞硫酸鹽法測序(WGBS)需要極端反應條件的缺陷,可以廣泛應用于包含 ctDNA 在內的微量脆弱 DNA 樣品。運用 EM-seq 技術,僅需低至 10 ng 的 DNA 樣品便可進行單堿基精度的全基因組 5mC 修飾測序。

      EM-seq 的優勢相比于傳統的WGBS 擁有多種優勢:
      2.1 DNA 測序文庫質量高、所需 DNA 起始量小
      相比于WGBS,EM-seq 對 DNA 的損傷小,因此可以用更少 DNA 樣品、更少的 PCR 輪數擴增出高質量的測序文庫。云序生物提供的 EM-seq 服務,所需的 DNA 起始量可低至10ng。
      2.2 DNA 文庫的插入片段更長、更完整
      相比于WGBS,EM-seq 處理后的 DNA 片段更完整,長度更長,避免產生測序缺口。
      2.3 出色的 GC 覆蓋均一性
      無論 GC 程度高低,EM-seq 的覆蓋度都有均勻且優良的表現;相比之下,WGBS 測序文庫高估了 AT 區,卻低估了 GC 區,造成“GC 覆蓋度偏誤”。
      2.4 均一的雙核苷酸分布
      由于“GC 覆蓋度偏誤”的存在,在連續雙核苷酸的檢出效率方面,WGBS 對于不同的雙核苷酸存在較嚴重的偏誤,而 EM-seq 則能展示出均一的覆蓋情況。
      2.5 更強的匹配率和更低的重復率
      相比于 WGBS,EM-seq 測序結果與參考基因組的匹配率更高,同時重復率更低。
      2.6 用更少的測序檢出更多的 CpG 島
      同等測序覆蓋深度的情形下,EM-seq 所發現的 CpG 數目要遠多于 WGBS,在這其中有很大比例的 CpG 位點是僅僅只能能用 EM-seq 法才能檢測到的。

      云序生物服務優勢

      優勢一:云序累計支持客戶發表 87 +篇RNA修飾及DNA修飾SCI論文,合計影響因子 810  +
      優勢二:累計完成數千例 RNA及DNA甲基化測序樣本,全面覆蓋醫口、農口等各類樣本。
      優勢三:全面檢測mRNA和各類非編碼RNA(circRNA,lncRNA,Pri-miRNA等)。
      優勢四:提供m5C一站式服務:m5C整體水平檢測、m5C-seq、MeRIP-qPCR驗證、RIPRNA pull-down等。
      優勢五:超微量MeRIP測序技術,RNA量低至500ng起。
      優勢六:全面提供多種 RNA 修飾測序服務,包含m6A、m6Am、m5C、m1A、m7G、m3C、O8G、ac4C乙?;?'-O-甲基化測序。
      優勢七:全面提供多種DNA修飾測序服務,包括5mC、5hmC、6mA等甲基化測序。

      云序客戶m5C及5mC修飾部分文章列表

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