1. 歡迎進入上海云序生物科技有限公司官方網站!?? 生物在線????丁香通

      服務熱線 021-64878766

      首頁 > 新聞動態 > 公司新聞

      用戶文章,1區 | 新型非編碼RNA piRNA測序揭示腦缺血神經損傷機制
      日期:2022年11月10日    來源:
      piRNA是一類長度約在 30 nt 左右的小型非編碼 RNA,最初在動物的生殖腺中發現。piRNA 往往與 PIWI 蛋白形成 piRNA 復合物,發揮 RNA 沉默以及 DNA 表觀遺傳學修飾等生物學功能。越來越多的證據顯示,piRNA 不僅分布于生殖腺中,而是與許多特定生理或病理條件下的細胞生存相關,然而 PIWI/piRNA 在腦缺血以及低氧后處理條件下的生物學功能仍有待研究闡釋。2022 年 6 月,云序客戶廣州醫科大學徐恩教授課題組在腦病理學領域專業雜志 Brain Pathology(IF=7.611)上發表了一篇 PIWI/piRNA 研究論文,揭示了低氧后處理條件下 Piwil2/piRNA 下調減輕腦缺血神經損傷的機制。云序生物有幸參與了該項研究當中的 Piwil2 蛋白RIP測序 以及piRNA 測序工作。

      圖片1.png

      圖片2.png


      論文標題Attenuation of Piwil2 induced by hypoxic postconditioning prevents cerebral ischemic injury by inhibiting CREB2 promoter methylation
      發表期刊:Brain Pathology(IF=7.611)
      研究方法RIP-seq、piRNA 測序、qPCR


      圖片3.png


      名詞縮寫:
      CA1:大腦海馬中的 CA1 區(cornu ammonis)
      tGCI:短暫全局性腦缺血(transient Global Cerebral Ischemia)
      HPC:低氧后處理(Hypoxic PostConditioning)
      AS-ODN:反義寡脫氧核苷酸(antisense oligodeoxynucleotide)
      aCSF:人工腦脊液( artificial cerebrospinal fluid)
      NeuN:神經元細胞核(Neuronal Neuclei)


      1、Piwil2 下調起到了神經保護作用
      作者準備了4組實驗大鼠,其中兩組未進行手術處理,剩余兩組都經過了短暫全局性腦缺血(tGCI)的手術處理。在未進行手術處理的大鼠當中,其中一組大鼠經歷了低氧條件(Hypoxia),另一組則沒有經歷低氧條件(作為對照組)。在進行了 tGCI 手術處理的大鼠當中,其中一組大鼠在其后經歷了低氧后處理(HPC),而另一組大鼠則沒有經歷 HPC 低氧后處理。作者隨后將這些大鼠大腦海馬當中的 CA1 區取出,針對 Piwil2 蛋白進行了免疫組化染色以及 Western Blot 檢測,發現 tGCI 處理可以增加 Piwil2 蛋白的表達,而 HPC 處理則可以減弱 tGCI 對 Piwil2 蛋白表達的增強作用;針對 Piwil2 mRNA 的 RT-qPCR 也呈現出類似的結果。作者通過設計熒光融合蛋白,認定 Piwil2 的亞細胞定位主要在神經元細胞核(NeuN)中;在 tGCI 組中,Piwil2 蛋白主要位于星形膠質細胞當中;而在 HPC 組中,Piwil2 蛋白主要位于神經元細胞當中。

      圖片4.png
      作者隨后給大鼠靜脈注射了 Piwil2 基因的反義寡脫氧核苷酸(AS-ODN),以實現 Piwil2 敲降,結果發現 Piwil2 基因的 AS-ODN 可以通過降低 Piwil2 的 mRNA 和蛋白表達水平來減輕 tGCI 處理后 CA1 區的神經元損傷。作者再給大鼠的大腦海馬區注射了攜帶 Piwil2 基因的慢病毒載體,以實現 Piwil2 基因的過表達。Piwil 2 的過表達削弱了 HPC 后的神經保護作用,引發了 CA1 區中生存細胞數以及 NeuN 陽性細胞數的降低。
      綜上所述,HPC 后在 CA1 區的 Piwil2 蛋白下調起到了拮抗 tGCI 效應的神經保護作用。
      圖片5.png



      2、Piwil2/piRNAs 通路靶向促進 DNMT3A 表達
      作者對 tGCI 處理組、tGCI+ HPC 處理組以及對照組的大鼠腦 CA1 區進行了 piRNA 測序,發現各組之間的 piRNA 譜存在系統性的差異。組間差異 piRNA 主要富集于軸突引導(axon guidance)和突觸功能(synaptic functions)相關的 KEGG 通路當中。有 12 個 piRNA 在 tGCI 組當中相比于對照組存在顯著差異上調,有 6 個 piRNA 在 HPC 組中相比于 tGCI 組存在顯著差異下調,有 9 個 piRNA 在 HPC 組中相比于對照組存在顯著差異下調——在這三部分 piRNA 當中,有 3 個 piRNA 重復出現,它們是:rno_piR_000618、 rno_piR_017990 和 rno_piR_014971。生物信息學分析還顯示,CREB2 是這三個 piRNA 共有的靶基因。
      圖片6.png
      為了探明 Piwil 2 蛋白與 piRNA 的結合關系,作者隨后對 tGCI 處理組、tGCI+ HPC 處理組以及對照組的大鼠腦 CA1 區進行了針對 Piwil2 蛋白的RIP以及piRNA 測序實驗。組間差異的 Piwil2 結合 piRNA 同樣主要富集于軸突引導(axon guidance)和突觸功能(synaptic functions)相關的 KEGG 通路當中。有 310 個 piRNA 在 tGCI 組當中相比于對照組存在顯著差異上調,有 394 個 piRNA 在 HPC 組中相比于 tGCI 組存在顯著差異下調,有 253 個 piRNA 在 HPC 組中相比于對照組存在顯著差異下調——在這三部分 piRNA 當中,有 7 個 piRNA 重復出現,它們擁有一個共同的靶基因 DNMT3A。作者隨后在對照、低氧、 tGCI、tGCI+HPC 低氧這四種條件下檢測了 CA1 區當中 DNMT3A 基因的 mRNA 和蛋白表達情況。結果顯示:tGCI 處理后 DNMT3A 的 mRNA 和蛋白水平上升,并且可以持續長達 50h;而 tGCI 后的 HPC 低氧處理則可以降低 DNMT3A 的 mRNA 和蛋白水平。作者進一步還發現,使用 AS-ODN 對 Piwil2 的敲降,可以導致 DNMT3A 的 mRNA 和蛋白水平降低;而 Piwil 2 的過表達,則可以導致 DNMT3A 的 mNRA 和蛋白水平升高。以上證據顯示,tGCI 后 CA1 區的 DNMT3A 表達受到 Piwil2/piRNAs 通路下調的負調控。
      圖片6.png

      3、Piwil2 通過促進 DNA 甲基化來抑制 CREB2 的表達
      至于先前發現的三個 piRNA 的共有靶基因 CREB2,它的蛋白水平在 tGCI 后呈現先上升、后下降的現象;而 HPC 處理則可以維持 CREB2 蛋白的高水平。CREB2 在 mRNA 水平也表現出相似的現象。由于 Piwi/piRNA 已知可以參與 DNA 甲基化,作者針對 CREB2 基因的 DNA 預測出了其啟動子上 CpG 島的存在,并通過 MSP 和 BSP 兩種甲基化 PCR 方法驗證了這些 DNA 甲基化位點的真實存在。其中,tGCI 組的 DNA 甲基化程度最高,對照組其次,而 HPC 處理后 DNA 甲基化程度最低。為了驗證 Piwil2 蛋白對于 CREB2 基因甲基化的必要性,作者還進行了 Piwil2 敲降,結果發現 tGCI 導致的 DNA 甲基化程度升高現象被逆轉。綜上所述,作者認為HPC 誘導的 Piwil2 下調通過抑制 DNA 甲基化來增強 CREB2 的。
      圖片8.png

      4、Piwil2 下調可改善神經元可塑性以及記憶功能

      作者在 tGCI 處理后一段時間對大鼠腦的海馬區域進行了高爾基染色(Golgi staining),發現 CA1 區的椎體神經元遭到了嚴重損壞,但是如果在 tGCI 后進行了 HPC 處理或 Piwil2 敲降,則損壞的程度減輕。Sholl analysis 結果也顯示,HPC 處理或 Piwil2 敲降組當中的樹突分支交叉數目高于 tGCI 組,這一差異在距離神經元細胞體 80 到 200 μm 處的樹突分支交叉體現得尤為明顯。細胞形態分析也顯示,tGCI 組的樹突長度以及樹突棘密度都比對照組下降,但 HPC 處理或 Piwil2 敲降則能減輕這一現象。為了檢驗神經元的這些變化是否影響大鼠的記憶和認知能力,作者還對大鼠進行了 Morris 水迷宮測試(Morris Water Maze),發現 tGCI 組大鼠的逃脫路徑長度(path length)以及逃脫用時(excape latency)都長于對照組,而 HPC 組大鼠和 Piwil2 敲降組的大鼠則在經過數日訓練后降低了逃脫路徑長度和逃脫用時,而不同組別的大鼠在游泳速度上并無差異,說明逃脫能力上的差異是由于認知能力差異而非體力差異造成的。綜上所述,HPC 誘導的 Piwil2 下調增強了海馬區神經元樹突棘的可塑性并起到改善記憶功能的作用。
      圖片9.png


      小   結

      在本研究中,作者描述了 Piwil2在通過表觀遺傳機制調節 CREB2表達和介導大鼠 tGCI 后 HPC 的神經保護中的作用。HPC 下調了 tGCI 后 CA1區域中 Piwil2的表達,并降低了 DNA 甲基轉移酶 DNMT3A 的水平,DNMT3A 反過來消除了 tGCI 誘導的 CREB2啟動子甲基化的增加,從而增加了 CREB2在 mRNA 和蛋白質水平。此外,HPC 誘導的 Piwil2的減少起到了恢復樹突復雜性和樹突長度的作用,并阻止了 CA1區域神經元樹突棘的喪失,從而改善了 tGCI 后大鼠的學習和記憶功能。
      圖片10.png



      云序生物服務優勢

      優勢一:云序累計支持客戶發表  240+ 篇SCI論文,合計影響因子近 2100 分,其中包含多篇高分小 RNA 測序類論文。

      優勢二:全面檢測各類非編碼RNA(piRNA, miRNA, tRNA, tiRNA&tRF, 細菌sRNA,circRNA,lncRNA,Pri-miRNA等)。

      優勢三:能夠一站式提供非編碼小RNA的機制研究,RIP測序,RNA pulldown,ChIP測序等多種服務,助力用戶解決機制研究


      云序客戶非編碼 RNA 部分高分論文


      daWS3tCVuS.png



      相關產品

      piRNA 測序

      miRNA 測序

      tRNA 測序

      tiRNA&tRF 測序

      細菌sRNA 測序

      全轉錄組測序

      lncRNA測序

      circRNA測序

      RNA pulldown

      RIP-seq
      ChIP-seq



      往期回顧

      一區,IF=25.841|云序客戶白金期刊成果,外泌體竟是心肌損傷“罪魁”!
      一區,IF=9.3|云序客戶Aging Cell揭示circRNA調控內皮細胞衰老的分子機制
      外泌體miRNA項目文章|近15分外泌體小RNA文章助力醫學治療新思路
      RIP-seq項目文章|nature子刊揭示低氧誘導AGO2線性泛素化調控腫瘤發生發展機制
      云序客戶Mol Cancer成果|教您如何發外泌體10分文章
      云序客戶文章|慢性硬膜下血腫外泌體microRNA抑制血腫吸收并加重神經功能缺損
      一區IF=9.225 | 云序生物細菌 sRNA 測序助力研究埃希氏菌對脂肪肝的促進作用
      云序用戶文章|胃癌 circRNA海綿機制榮登15分雜志
      新版logo二維碼.jpg
      上海云序生物科技有限公司
      地址: 松江區莘磚公路518號18號2樓
      網址: http://www.compagesolutions.com
      電話: 021-64878766
      郵箱: market@cloud-seq.com.cn

      3jNNVDgU708IWLO5sr6heIg+oI4b0q944OBNIdkpjVRV/cQkSCVIg1wzBnyrv4ua2iqxnc9qvPCLqe4uIulomu3DmHEYnB4KhmMWOMeJCNFA1jktxljNlqHGNYSVSL4yoT+f0k0w5o2yGxOm0jKKC0DN/wjD0pfZchP2pIP20lpaXNG2iBJbIOCh44b90Muk64DkxvgNnVV4VR6EdRYQ7w== 少妇BBw搡BBBB搡BBBB