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      云序用戶文章|IF=19.865,多組學分析助力非酒精性脂肪性肝病發病機制研究
      日期:2022年11月03日    來源:
      非酒精性脂肪性肝?。∟AFLD)是由肝臟脂質代謝失衡引起的,但發病機制尚未完成闡明。2022年9月1日,云序客戶的研究者們在Nature Metabolism(IF=19.865)雜志上發表了文章“Orosomucoid 2 maintains hepatic lipid homeostasis through suppression of de novo lipogenesis”。該研究通過多種小鼠模型,首次揭示了肝臟分泌因子Orosomucoid 2 (ORM2)通過特異性抑制脂質從頭合成途徑(DNL),維持肝臟和全身脂質穩態的作用。此項研究結果表明,肝臟ORM2信號通路是脂質代謝重要調節因子,為NAFLD、NASH和高脂血癥提供了一個潛在的干預靶點。云序生物有幸參與了此項研究中的RNA-seq、磷酸化蛋白質譜、CoIP-質譜法等高通量技術服務。
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      發表期刊:Nature Metabolism
      影響因子:19.865
      發表時間:2022年9月1日
      研究方法:RNA-seq、磷酸化蛋白質譜、CoIP-質譜法

      文章鏈接:Orosomucoid 2 maintains hepatic lipid homeostasis through suppression of de novo lipogenesis


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      研究內容

      1. ORM2在NAFLD小鼠中下調
      為了探究ORM2是否參與肝臟脂質調節,作者使用了三種類型的NAFLD小鼠模型(瘦素受體缺陷的db/db、瘦素缺陷的ob/ob、高脂飲食喂養的HFD)檢測了其在肝臟和血漿中的表達。結果顯示,與對照組相比,NAFLD小鼠的肝臟和血漿中ORM2蛋白水平均顯著降低(圖1a-f)。
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      圖1. ORM2在NAFLD小鼠肝臟和血漿中下調


      2. ORM2缺失促進小鼠肝臟脂質積累
      ORM2在NAFLD中表達下調提示其可能參與了肝臟TG代謝的調控。因此,作者構建了ORM2基因野生型(WT)、雜合子(HE)和敲除(KO)小鼠(圖2a-b)用于后續研究。與WT小鼠相比,KO小鼠肝臟中ORM2的mRNA表達水平極低,而ORM1和ORM3的mRNA水平均不受ORM2缺失的顯著影響,證實了KO小鼠肝臟中ORM2的缺失,且沒有ORM1和ORM3的代償性上調(圖2c)。值得注意的是,在正常飼料(ND)喂養下,與WT小鼠相比,KO小鼠的肝臟與體重比、肝臟和血漿TG水平顯著升高(圖2d-g)。同時,與野生型雌性小鼠相比,ORM2缺陷的雌性小鼠的肝臟和血漿TG水平升高(圖2h-l)。因此,ORM2可能在肝臟TG穩態的生理維持中發揮不可或缺的作用,且ORM2在肝臟和全身TG穩態中的保護作用可能與性別無關。
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      圖2. ORM2 KO雄性和雌性小鼠在ND條件下均表現出肝臟TG的積累


      3. ORM2缺乏會加劇飲食引起的肝脂肪變性
      作者用HFD喂養小鼠8周,以誘導單純性脂肪變性后,發現與野生型小鼠相比,KO小鼠發生了更嚴重的肝脂肪變性,肝體重比更高,肝臟和血漿TG水平升高(圖3a-c),脂質積累加重(圖3b-d)。接下來,作者用HFHC飲食喂養小鼠24周,以誘導NASH發病機制。與WT小鼠相比,HE和KO雄性小鼠的肝重比更大,肝臟和血漿TG含量更高(圖3e-g)。ORM2缺陷小鼠的血漿ALT和AST水平顯著升高(圖3h-i),同時表現出F4/80陽性巨噬細胞豐度增加和更嚴重的肝纖維化(圖3j-l)。在HE和KO小鼠的肝臟中,參與肝臟炎癥和纖維化的基因的表達水平一致上調(圖3m)。以上數據表明,ORM2缺乏加劇了飲食誘導的脂肪變性和脂肪性肝炎。
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      圖3. ORM2缺乏加劇了飲食誘導的肝臟脂質沉積和脂肪性肝炎


      4. ORM2過表達可減輕肝脂肪變性和高脂血癥
      為了探究肝臟特異性過表達ORM2是否可以降低肝臟TG水平,改善脂肪變性,作者通過尾靜脈注射腺病毒(Ad),以構建肝臟ORM2過表達ob/ob小鼠(圖4a-c),以及Ad-GFP陰性對照小鼠。結果表明,Ad-ORM2處理對體重和食物攝入量沒有影響(圖4d-e),但Ad-ORM2小鼠的肝臟體重比、肝臟和血漿TG含量顯著低于表達Ad-GFP的小鼠(圖4f-h)。在ORM2過表達的小鼠中,脂滴較小,含量較少(圖4i),血漿總膽固醇(TC)和LDL-C水平較低(圖4j-k)??傊?,ORM2表達恢復可以改善肥胖相關的肝脂肪變性和血脂異常。為了進一步確定ORM2的保護作用,作者使用肝特異性甲狀腺激素驅動的腺相關病毒(AAV)9型AAV-GFP或AAV-ORM2,尾靜脈注射C57BL/6J雄性小鼠后,將小鼠ND或HFD喂養12周,分別命名為ND/AAV-GFP、HFD/AAV-GFP和HFD/AAV-ORM2。與ND/AAV-GFP小鼠相比,HFD/AAV-GFP和HFD/AAV-ORM2小鼠的體重逐漸增加,但后兩組間小鼠的體重沒有明顯區別(圖4l)。WB結果顯示,與ND/AAV-GFP小鼠相比,HFD/AAV-GFP小鼠肝臟中ORM2蛋白水平降低(圖4n),但在HFD/AAV-ORM2小鼠肝臟中表達恢復(圖4n)。與ND/AAV-GFP小鼠相比,HFD/AAV-GFP小鼠的肝/體重比、肝和血漿TG含量、脂滴積累以及血漿TC和LDL-C水平顯著升高(圖4o-t)。值得注意的是,AAV-ORM2治療顯著緩解了HFD相關的脂質代謝惡化(圖4o-t)。因此,這些發現表明AAV介導的ORM2表達可以防止HFD誘導的肝脂肪變性和血脂異常的發生。
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      圖4. ORM2過表達可減輕肥胖小鼠的肝脂肪變性和高脂血癥

      5. ORM2抑制脂肪生成基因的表達
      為了探究ORM2維持肝臟脂質穩態的下游靶點,作者對Ad-ORM2和Ad-GFP轉導的ob/ob小鼠的肝臟進行了RNA-seq測序分析,結果顯示Ad-ORM2處理抑制了大多數基因(圖5a)。以P值<0.05和fold change >2.0為差異閾值,作者發現表達Ad-ORM2的ob/ob小鼠肝臟中有90個基因(28.75%)表達上調,223個基因表達下調(71.25%)(圖5b)。GO分析表明,下調的基因在脂肪酸代謝過程中高度富集(圖5c)。RT-qPCR證實,表達Ad-ORM2的ob/ob小鼠中SREBP-1c及其下游基因(Fasn、Scd1和Acc1)的mRNA表達水平顯著降低(圖5d)。通過對肝提取物進行免疫印跡證實,在蛋白水平上也出現了脂肪生成基因的下調(圖5e)。Ad-ORM2轉導也導致db/db小鼠(圖5f、g)和HFD小鼠(圖5h、i)肝臟中脂肪生成基因的表達顯著降低。此外,與HFD/AAV-GFP小鼠相比,HFD/AAV-ORM2小鼠的脂肪生成基因表達減少,達到了與ND/AAV-GFP小鼠相似的水平(圖5j,k)。與WT小鼠相比,在ND或HFD喂養條件下,ORM2 HE和KO小鼠的肝臟中均脂肪生成基因表達上調(圖5l-o)。這些發現表明,ORM2可能通過下調與DNL相關的基因表達來維持肝脂質穩態。
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      圖5. ORM2下調脂肪生成基因


      6. ORM2激活ca2+-CaMKK2-AMPK信號通路抑制DNL
      為了探究對ORM2應答的細胞內信號通路,作者使用來自Ad-ORM2或Ad-GFP轉導的ob/ob小鼠的肝臟進行了磷酸化蛋白質譜分析?;诓町惲姿峄募捌銴EGG通路的富集,作者發現AMPK信號通路被高度激活(圖6a-b)。WB證實,與表達Ad-GFP的ob/ob小鼠相比,表達Ad-orm2的ob/ob小鼠肝臟中AMPK及其靶點ACC的磷酸化水平顯著增強(圖6c)。在ORM2過表達的小鼠中,mTOR信號,包括mTOR和P70S6K的磷酸化被抑制(圖6c);而AKT和STAT3的磷酸化狀態在Ad-ORM2處理后沒有改變(圖6c)。同樣,在過表達ORM2的db/db小鼠的肝臟中,可以觀察到AMPK信號通路的激活和mTOR信號通路的抑制(圖6d)。接下來,作者進行了體外研究來檢測ORM2對肝細胞的直接作用。結果發現,內源性ORM2的敲除顯著增加了HPHs中細胞TG的積累,并上調了脂肪生成基因的表達(圖6e-g)。相反,ORM2重組蛋白處理顯著降低了HPHs中細胞TG含量,下調了脂肪生成基因(圖6h-i)。同時,無論是ORM2敲低還是處理,參與脂肪酸氧化和脂質轉運的基因的表達水平均不受影響(圖6g-i)。此外,肝臟特異性Prkaa1和Prkaa2雙敲除(DKO)雄性小鼠(Prkaa DKO)的MPHs顯示,ORM2介導的對細胞TG積累和脂肪生成基因表達的抑制顯著消失(圖6j-l)。因此,AMPK激活是ORM2必要的下游信號效應器。此外,Prkaa WT肝細胞顯著降低了DNL率(圖6n);然而,Prkaa DKO細胞中這種作用減弱(圖6o)。同時,重新引入ORM2顯著抑制了ORM2 KO肝細胞中的DNL率(圖6p),OTO-609明顯消除了ORM2對DNL率的抑制(圖6q)??傊?,這些發現證明了ORM2在抑制DNL中的直接作用,而DNL依賴于CaMKK2和AMPK。
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      圖6. ORM2激活AMPK信號來抑制DNL


      7. ORM2與ITPR2相互作用的鑒定
      為了鑒定負責ORM2抑制脂肪生成作用的肝臟受體,作者將HA標記的ORM2表達質?;駿V轉染到HEK 293T細胞中,HA-ORM2轉染顯著增強了AMPK的磷酸化(圖7a)。然后,作者通過CoIP-質譜法鑒定與ORM2相互作用的蛋白,篩選到了120多種蛋白質。其中,ITPR2和ITPR3已被證實可介導哺乳動物細胞內Ca2+信號網絡。因為ITPR3在正常肝臟中缺失,而ITPR2高表達,可定位于肝細胞的質膜(圖7b),所以用于后續研究。ORM2和ITPR2之間的物理相互作用也通過免疫共沉淀和接近連接實驗(PLA)得到證實(圖7c-e)。為了確定ITPR2與ORM2互作位置,作者使用了ITPR2的幾種截斷形式,分析顯示,ITPR2與ORM2相互作用需要結構域(氨基酸226-576)(Fig.7f-g)。然后,為了探究ITPR2的阻斷是否會影響ORM2在體內的抗脂作用,作者通過尾靜脈注射ob/ob雄性小鼠,給予靶向ITPR2的shRNA或陰性對照,然后用ORM2重組蛋白或載體對照處理。結果發現,注射shRNA ITPR2顯著降低了ITPR2在肝臟中的表達(圖7h)。雖然四組之間的體重和食物攝入量具有可比性(圖7i-j),但ITPR2的下調顯著阻斷了ORM2對肝臟脂肪變性、高脂血癥和脂肪生成基因表達水平的保護作用(圖7k-q)。綜上所述,ORM2通過涉及Ca2+、CaMKK2和AMPK的ITPR2依賴的信號級聯來抑制肝臟脂肪生成。
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      圖7. ORM2的肝臟益處需要ITPR2


      8. 重組ORM2可改善小鼠肝臟脂肪變性和NASH
      ORM2蛋白處理后,ob/ob小鼠肝體重比、肝臟和血漿TG含量、肝脂質積累呈劑量依賴性下降(圖8a-d)。與此同時,ob/ob小鼠中脂肪生成基因和促炎基因的表達水平降低,AMPK信號通路被顯著激活,而mTOR和P70S6K的磷酸化水平逐漸降低(圖8e-g)。ORM2顯著逆轉了HFHC飼糧誘導的肝體重比和肝TG含量的升高,與此相一致,ORM2處理后降低了血漿ALT和AST水平(圖8h-k)。組織學分析顯示,飲食誘導的肝脂質積累、炎癥和肝纖維化明顯減輕(圖8l-o)。肝臟的益處伴隨著肝臟炎癥和纖維化相關基因的表達減少(圖8p)。綜上所述,重組ORM2蛋白具有治療NAFLD和NASH的潛力。
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      圖8. 重組ORM2蛋白可改善飲食誘導的小鼠肝脂肪變性和脂肪性肝炎


      小  結

      此項研究采用了RNA-seq、磷酸化蛋白質譜、CoIP-質譜法多組學高通量技術,確定了ORM2在抑制肝臟脂質合成和減輕肝臟脂質沉積方面的作用,發現了ORM2激活Ca2+-CaMKK2-AMPK信號通路抑制DNL。該文章為理解肝臟脂質穩態的調節機制提供了一個新的見解。此外,ORM2可能是治療NAFLD、NASH、動脈粥樣硬化和高脂血癥的潛在干預靶點。


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