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      用戶文章|1區 IF=17.694:m6A MeRIP-seq 助力饑餓條件下的細胞自噬研究
      日期:2022年10月25日    來源:
      m6A 修飾是真核細胞 mRNA 代謝的基本決定因素,參與了許多生理和病理過程。然而,m6A 修飾在饑餓誘導的細胞自噬中所扮演的具體角色尚不清楚。2022 年 10 月 4 日,云序客戶南方醫科大學肖東教授課題組在 Nature Communications 雜志上發表題為“Autophagy induction promoted by m6A reader YTHDF3 through translation upregulation of FOXO3 mRNA”的研究論文。該文章發現 YTHDF3 以 METTL3 依賴的方式,識別 FOXO3 mRNA 上特定區域的 m6A 修飾,并在 eIF3a 和 eIF4B 的幫助下促進 FOXO3 mRNA 的翻譯,進而促進細胞自噬相關的一系列基因的表達。云序生物有幸參與了本項研究當中的m6A MeRIP-seq等工作。
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      發表期刊:Nature Communications(IF=17.694)
      發表日期:2022 年 10 月 4 日
      客戶單位:南方醫科大學
      研究方法:m6A MeRIP-seq、RIP-seq 、co-IP 、蛋白質譜、LC-MS/MS 核酸修飾整體水平檢測、qPCR

      術路線

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      1、YTHDF3 的上調是自噬誘導的必要條件
      作者通過蛋白質譜實驗發現,在低營養饑餓處理的小鼠胚胎成纖維細胞系當中,YTHDF3 這個 m6A Reader 蛋白的水平**升高。為了檢驗 YTHDF3 對于自噬的作用,作者設計了 YTHDF3 敲降的細胞系,發現自噬標志蛋白 LC3-II 在 YTHDF3 敲降細胞系饑餓處理后下降,但自噬溶酶體中本來應該被消化的蛋白 p62 卻在 YTHDF3 敲降細胞系饑餓處理后上升,說明 YTHDF3 敲降降低了自噬流(autophagy flux)現象。如果在 YTHDF3 敲降細胞中使用載體復原 YTHDF3,則 LC3-II 蛋白濃度升高,而 p62 蛋白則逐漸被消化。如果過表達 YTHDF3,則進一步升高 LC3-II、降低 p62 蛋白的水平。作者還使用 CRISPR/Cas9 系統構建了 YTHDF3 完全敲除的純合子小鼠胚胎,熒光顯微鏡觀察發現細胞中自噬小體和自噬溶酶體的數目明顯減少。綜上所述,作者認為 YTHDF3 的上調對于饑餓處理條件下的自噬誘導是不可或缺的。
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      2、YTHDF3 需要 METTL3 介導的 RNA m6A 修飾來促進自噬作用
      由于 YTHDF3 是一個 m6A Reader 蛋白,作者因此假設 YTHDF3 可能通過 m6A 來促進自噬作用。通過LC-MS/MS 檢驗 m6A 的整體水平,作者發現饑餓處理后細胞中 mRNA 的 m6A 整體水平升高。通過 Western Blot 檢測 m6A 經典 Writters 和 Erasers 的蛋白質水平,作者發現饑餓處理可以**提升 m6A Writter 蛋白 METTL3 的水平。作者于是設計 METTL3 敲降細胞系,通過LC-MS/MS 檢驗 m6A 的整體水平,發現 METTL3 敲降后細胞中 mRNA 的 m6A 整體水平下降。為了檢測饑餓處理條件下細胞中 METTL3 蛋白的活性,作者在小鼠胚胎成纖維細胞中構建了 METTL3 FLAG 標記融合蛋白,并使用分離得到的 METTL3 FLAG 標記融合蛋白在氘(deuterium)同位素標記的 d3-SAM 作為甲基供體的體外環境下催化含有 RRACH 保守基序(motif)的 RNA 探針發生 m6A 甲基化修飾。結果顯示:饑餓細胞中分離得到的 METTL3 蛋白比對照組細胞來源的 METTL3 蛋白對體外 RNA 探針實現了更高比例的 d3-m6A 修飾,說明饑餓處理可以提升 METTL3 蛋白的 m6A 修飾能力。作者因此懷疑 METTL3 介導的 m6A 修飾可能對于 YTHDF3 促進自噬作用至關重要。為了驗證這一假設,作者在 YTHDF3 過表達的細胞中敲降 METTL3,結果發現饑餓誘導的 LC3-II 積累和 p62 降解現象均得到了**的減弱。在饑餓處理的 YTHDF3 過表達細胞中,METTL3 的敲降可導致自噬小體和自噬溶酶體的減少。在此基礎上,使用野生型 METTL3 基因質粒轉染可以在 LC3-II 蛋白水平上提升自噬作用,但使用無催化活性的突變型 METTL3 基因質粒轉染則起不到復原的效果。綜上所述,YTHDF3 需要 METTL3 介導的 RNA m6A 修飾來促進自噬作用。
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      3、饑餓條件下,受抑制的 RPS27a-METTL3 結合關系起到了穩定 METTL3 蛋白的作用

      接著,作者進一步探究 METTL3 的 mRNA 水平上是否在饑餓條件下受到了調控。qRT-PCR 結果顯示,隨著饑餓處理時間的增加,METTL3 的 mRNA 水平也緩慢增加。然而,METTL3 的 mRNA 穩定性在饑餓組和對照組細胞中并無**差異,說明饑餓對于 METTL3 的調節作用主要并非發生在 mRNA 水平,而是在蛋白質水平:在蛋白酶體抑制劑處理下,饑餓組和對照組細胞中 METTL3 的蛋白質水平幾乎一致;而在蛋白合成抑制劑處理下,饑餓組中的 METTL3 蛋白質水平就明顯高于對照組;在饑餓組中,METTL3 蛋白的泛素化水平也**降低。為了探究 METTL3 蛋白的泛素化機制,作者構建了 METTL3 FLAG 標記融合蛋白,并針對這個融合蛋白進行了co-IP 蛋白質譜實驗,發現了多個泛素化相關蛋白與 METTL3 蛋白存在結合。根據以往文獻報道,作者選取了其中一部分蛋白進行進一步研究,其中 RPS27a 蛋白與 METTL3 的結合受到饑餓處理的損害,但饑餓處理并不會降低 RPS27a 本身的蛋白水平。通過針對 RPS27a 的 miRNA 干擾,發現 METTL3 蛋白在 siRPS27a 的處理條件下得到上調。綜上所述,RPS27a 是一個與 METTL3 蛋白結合并促進其泛素化降解的蛋白,在饑餓條件下,受抑制的 RPS27a-METTL3 結合關系起到了穩定 METTL3 蛋白的作用。
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      4、YTHDF3 識別 FOXO3 mRNA 上在饑餓條件下誘導產生的 m6A 修飾

      針對 YTHDF3 蛋白,作者進行了兩次**的RIP-seq 實驗,在饑餓組中分別發現了 4881 和 5013 個 YTHDF3 結合峰,在對照組中分別發現了 2997 和 2865 個 YTHDF3 結合峰。通過將上述兩個生物學重復中檢測到的轉錄本取交集,作者發現了饑餓條件下 3424 個 YTHDF3 結合上調的轉錄本和 1814 個 YTHDF3 結合下調的轉錄本,其中有 1041 個 YTHDF3 **結合上調的轉錄本和 535 個 YTHDF3 **結合下調的轉錄本(以 fold change **值 1.8 為閾值,定義“**結合上/下調”)。YTHDF3 結合位點呈現出“GGAC”的特征 motif。這些結合點大多位于蛋白質編碼區序列(CDS)和 3′UTR 當中,特別是集中于終止密碼子附近。以上這些特征與以往文獻中報道的 m6A 修飾峰的特征相似,因此作者認為 YTHDF3 結合的這些區域主要是發生了 m6A 修飾的區域。


      作者隨后對饑餓處理的細胞和對照組細胞進行了  m6A MeRIP-seq,發現了饑餓組中 2811 個峰的 m6A 甲基化程度上升,2552 個峰的 m6A 甲基化程度上升。為了尋找 YTHDF3 的 m6A 靶標,作者將 YTHDF3 RIP-seq 當中饑餓組的富集峰與 m6A MeRIP 測序當中饑餓組上調的峰取交集,得到了 86 個交集峰。其中,有 7 個基因富集到了 GO 條目 0006914 當中,也就是自噬(Autophagy)通路,它們包括了:FOXO3, BMF, DDIT3, AP4M1, SESN2, ZFYVE1, 和 ZFYVE26 這 7 個基因。通過針對 YTHDF3 的 RIP-qPCR,這 7 個基因當中的 6 個都被驗證了與 YTHDF3 蛋白在饑餓處理條件下的結合,并且 FOXO3 在 RIP-qPCR 中的富集尤其明顯。根據早前的文獻報道,FOXO3 是一個參與自噬的重要轉錄因子。進一步的免疫印跡實驗顯示,敲降 YTHDF3 可以降低 FOXO3 和 ZFYVE1 的表達,而過表達 YTHDF3 則會起到反效果。作者額外選取了自噬相關的幾個經典基因進行免疫印跡實驗,但發現它們的表達都和 YTHDF3 無關。早前的文獻報道顯示,ZFYVE1 基因并不抑制自噬作用,因此作者將其也排除了,*留下 FOXO3 基因進行后續的研究。YTHDF3 RIP-seq 以及 m6A MeRIP-seq 實驗結果已經顯示,在饑餓條件下,FOXO3 基因 mRNA 上的 m6A 修飾峰位于 CDS 和 3'UTR 當中。為了驗證 YTHDF3-FOXO3 mRNA 互作依賴于 METTL3 介導的 m6A 修飾,作者在細胞系中敲降了 METTL3,m6A MeRIP-qPCR 結果顯示,無論是在 FOXO3 mRNA 的 CDS 還是 3'UTR 區域,都出現了 m6A 修飾水平的下降;YTHDF3 RIP-qPCR 結果則顯示,YTHDF3-FOXO3 mRNA 結合升讀也下降。作者進一步設計了 YTHDF3 重組蛋白,還設計了生物素標記的帶有或不帶有 m6A 修飾的 FOXO3 mRNA 的 CDS 區和 3'UTR 區的多種 RNA 探針,進行 EMSA 實驗。結果顯示,對于 YTHDF3 重組蛋白,無論是對于 CDS 區還是 3'UTR 區,只要是帶有 m6A 修飾的探針,EMSA 信號就強;只要是不帶 m6A 修飾的探針,EMSA 信號就弱。其中,落在 CDS 區內的兩個探針的 EMSA 信號尤其強,其覆蓋范圍包括了 2158nt, 2151nt, 2163nt 和 2295nt 這幾個關鍵的腺苷酸位點,它們可能幫助 YTHDF3 識別 FOXO3 的終止密碼子??傊?,上述實驗結果證明饑餓條件下 METTL3 介導的 m6A 高甲基化對于 YTHDF3-FOXO3 mRNA 的識別互作是必不可少的。
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      5、YTHDF3 通過 FOXO3 促進自噬

      作者敲降 YTHDF3 后,發現 FOXO3 蛋白水平**降低,而 YTHDF3 過表達,則會使得 FOXO3 蛋白水平**升高。作者選取了幾個與自噬有關的 FOXO3 目標基因,發現這些基因在 YTHDF3 敲降后 mRNA 水平和蛋白水平均下降,而在 YTHDF3 過表達后 mRNA 水平和蛋白水平均上升。METTL3 則是一個大前提因素,如果敲降 METTL3,那么即使是在 YTHDF3 過表達的饑餓細胞中,FOXO3 的蛋白表達水平升高程度也會**減弱。對于大多數 FOXO3 目標基因(包括 ULK1,ATG13,ATG14 等),在 METTL3 敲降后它們的蛋白表達降低,而在 METTL3 過表達后他們的蛋白表達增強。這些數據進一步表明,YTHDF3 以 METTL3 依賴的方式,調節了 FOXO3的表達,并間接調節 FOXO3 目標基因的表達,從而影響自噬作用。

      作者還在 YTHFD3 敲降細胞系中進行了 FOXO3 回補實驗,發現 FOXO3 蛋白水平得以復原,并且自噬標志蛋白 LC3-II 的表達也得到復原,而自噬溶酶體中的蛋白 p62 則在 FOXO3 回補后逐漸被消化掉。類似的結果(自噬小體和自噬溶酶體的增加)也在熒光顯微鏡實驗中發現,進一步印證了 YTHDF3 通過 FOXO3 促進自噬。
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      6、YTHDF3 促進 FOXO3 的翻譯,但是不影響 FOXO3 mRNA 的穩定性

      早前的報道顯示,YTHDF3 可能通過與核糖體互作而促進 RNA 翻譯,也可能通過與 YTHDF2 互作而降低 mRNA 穩定性。作者發現,YTHDF3 敲降細胞相比于對照組而言,FOXO3 的 mRNA 水平并不發生變化。即使用轉錄抑制劑 Act D 處理,YTHDF3 敲降細胞與對照組相比,FOXO3 的 mRNA 水平同樣沒有明顯差異。因此作者猜測 YTHDF3 更可能通過促進 FOXO3 翻譯來起作用,而非影響 FOXO3 的 mRNA 穩定性。于是作者進行了多聚核糖體分析(Polysome profiling)來檢測 FOXO3 的翻譯,發現在 YTHDF3 敲降組中,FOXO3 的 mRNA 分布在多聚核糖體中的水平要低于對照組,說明 FOXO3 的蛋白翻譯活躍程度下降。

      作者隨后進行了點突變實驗,來驗證 FOXO3 mRNA CDS 區上 m6A 峰中的 m6A 修飾對 YTHDF3 識別的作用。作者將 FOXO3 CDS 區上*接近終止密碼子的 m6A 修飾經典 motif RRACH 上的腺苷(A)突變為了胸苷(T),發現對于突變型的 FOXO3 mRNA 而言,YTHDF3 不能再起到促進 FOXO3 翻譯的作用。這說明 FOXO3 CDS 區上的*接近終止密碼子的 m6A 修飾是 YTHDF3 的識別對象。作者也針對 FOXO3 mRNA 上 3'UTR 上的 m6A 修飾做了類似的點突變工作,并通過熒光素酶報告實驗驗證了 3'UTR 上的 m6A 修飾與 YTHDF3 的互作。
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      7、YTHDF3 通過與 eIF3a 和 eIF4B 互作來促進 FOXO3 翻譯

      作者針對 YTHDF3 蛋白進行了  co-IP 蛋白質譜檢測,發現了多種與 YTHDF3 結合的轉錄因子蛋白質。其中,在饑餓處理的細胞當中,eIF3a 和 eIF4B 是與 YTHDF3 結合程度**的兩個轉錄因子。針對不同的核糖體組分的 Western Blot 實驗以及分子對接(docking)生物信息學分析預測都顯示,YTHDF3 蛋白與 eIF3a 和 eIF4B 很可能存在分子互作。作者還針對 YTHDF3 蛋白進行了 co-IP 實驗,結果顯示 YTHDF3 蛋白與 eIF3a 和 eIF4B 確實存在結合。并且,YTHDF3 蛋白與 eIF3a 和 eIF4B 的結合還不依賴于任何 RNA,RNase A 處理并不影響 co-IP 中發現的 YTHDF3 蛋白與 eIF3a 和 eIF4B 的結合。然而,倘若敲降 eIF3a 或 eIF4B 的 mRNA,會降低 FOXO3 的蛋白水平,按時可能抑制了 FOXO3 的蛋白翻譯過程。綜上所屬,YTHDF3 可能通過與 eIF3a 和 eIF4B 互作來促進 FOXO3 翻譯。此外,針對 YTHDF3 的 co-IP 蛋白質譜還發現,PABP1 和 eIF4G2 這些在抗病毒先天免疫當中發揮功能的蛋白也與 YTHDF3 存在互作,然而它們之間的互作在饑餓處理后減弱了,而非像 eIF3a 和 eIF4B 那樣在饑餓處理后與 YTHDF3 結合增強。這說明不同轉錄因子與 YTHDF3 的結合,在饑餓條件下會發生不同的調控。
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      小   結


      總結而言,在營養饑餓條件下,m6A Reader 蛋白 YTHDF3 和 m6A Writter 蛋白 METTL3 發生上調。METTL3 在 FOXO3 mRNA 上終止密碼子前后 CDS 區域 和 3'UTR 區域催化形成了一些關鍵的 m6A 修飾位點,YTHDF3 則負責識別這些 m6A 修飾,并召集 eIF3a 和 eIF4B,從而促進 FOXO3 的蛋白翻譯。大量翻譯產生的 FOXO3 蛋白隨后進入細胞核,促進一系列目標基因的轉錄,從而間接起到促進自噬的作用。
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      云序生物m6A修飾研究五大模塊


      01 m6A RNA修飾測序
      m6A RNA修飾測序(m6A-meRIP-seq
      對m6A RNA甲基化,目前***的檢測手段為m6A-MeRIP-Seq技術,適用于m6A RNA甲基化譜研究,快速篩選m6A RNA甲基化靶基因。云序可提供mRNA和多種非編碼RNA的m6A測序:
      • m6A 全轉錄組測序(涵蓋mRNA,LncRNA,circRNA)
      • m6A  LncRNA測序(涵蓋LncRNA和mRNA)
      • m6A  Pri-miRNA測序(涵蓋Pri-miRNA和mRNA)
      • m6A  mRNA測序
      • m6A  miRNA測序
      02 檢測整體m6A RNA修飾水平
      LC-MS/MS檢測整體RNA修飾水平
      **高效,可以實現一次檢測,9類修飾水平檢測,一步到位。
      比色法檢測整體RNA修飾水平
      快速檢測m6A整體甲基化水平

      03 m6A RNA修飾上游酶的篩選
      m6A RNA修飾相關酶PCR芯片
      尋找上游直接調控m6A RNA甲基化的甲基轉移酶。

      04 m6A RNA修飾靶基因驗證

      MeRIP-qPCR/GenSeq® MeRIP試劑盒

      云序提供各類不同修飾的meRIP-qPCR服務以及銷售GenSeq® MeRIP試劑盒,可針對mRNA,lncRNA,環狀RNA等不同類型的RNA分子進行檢測,低通量驗證RNA修飾靶基因表達水平。

      05 機制互作研究

      5.1 RIP-seq/qPCR/GenSeq® RIP試劑盒

      篩選或驗證RNA修飾直接靶點,研究RNA修飾靶基因的調控機制。
      5.2 RNA pull down -MS/WB
      篩選或驗證目標RNA互作基因或蛋白,研究相應的分子調控機制。
      5.3 雙熒光素酶實驗
      驗證兩基因互作,研究相應的分子調控機制。
      5.4 ChIP-seq
      篩選或驗證目標蛋白與DNA互作,研究相應的分子調控機制。


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      優勢一:云序累計支持客戶發表  83  +篇RNA修飾SCI論文,合計影響因子 795  +
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      優勢四:提供m6A一站式服務:m6A整體水平檢測、m6A測序、MeRIP-qPCR驗證、RIPRNA pull-down等。

      優勢五:率先研發微量MeRIP測序技術,RNA量低至500ng起。

      優勢六:國內較全的RNA修飾測序平臺,提供m6A、m5C、m1A、m7G、m3C、O8G、ac4C乙?;?'-O-甲基化測序。


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