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      1區,if=38 單細胞測序聯合空間轉錄組揭示間質性膀胱炎的免疫圖譜
      日期:2022年10月13日    來源:
      間質性膀胱炎(IC)是指膀胱疼痛綜合征,以強烈的盆腔疼痛和尿路癥狀為特征,是一種嚴重的慢性疾病。為了研究免疫在IC膀胱中的作用,四川大學華西醫院的研究者們使用單細胞RNA測序(scRNA-seq)對15名女性IC患者和9名應激性尿失禁對照組的135,091個CD45+免疫細胞進行了測序。并整合scRNA-seq空間轉錄組學的結果,于2022年5月20日在Signal Transduct Target Ther發表文章“Integrating single-cell RNA sequencing with spatial transcriptomics reveals immune landscape for interstitial cystitis”。文章發現在IC膀胱中幾乎所有免疫亞群都富集在尿路上皮區或于成纖維細胞附近,但在對照膀胱中卻出現在尿路上皮和平滑肌細胞周圍,這些發現描述了IC的免疫景觀,并為IC的病理生理學提供有價值的見解。
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      發表期刊:Signal Transduct Target Ther
      影響因子:38.104
      發表時間:2022年5月20日
      研究方法:scRNA-seq、空間轉錄組學
      文章鏈接:Integrating single-cell RNA sequencing with spatial transcriptomics reveals immune landscape for interstitial cystitis


      技術路線

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      研究內容

      01  IC膀胱中CD45+免疫細胞的單細胞轉錄譜
      為了在 IC 中重現精確的免疫學圖景,作者使用了scRNA-seq。相比于計算大量細胞轉錄水平均值的批量測序方法,scRNA-seq可以體現細胞之間的轉錄水平異質性(圖1a)。膀胱病理特征結果表明,與對照組相比,IC膀胱出現尿路上皮剝脫或解剖丟失、血管生成和免疫細胞浸潤等現象(圖1b)。對從24個樣本中分離出的135,091個CD45+免疫單細胞進行測序分析,經過嚴格的質量控制后,作者對92,029個高質量的CD45+免疫細胞進行了進一步分析(圖1c)。并發現細胞計數與基因之間的相關系數高(R = 0.8995),但細胞計數與線粒體基因之間相關系數較低(R =?0.006)(圖1d)。隨后用主成分分析(PCA)進行降維,然后采用均勻流形近似和投影(UMAP)方法進行可視化。檢測到7種*明顯的造血和組織譜系定義基因的細胞類型,包括T細胞:CD3E(51193,55.6%),B細胞:CD79A(20090,21.8%),髓系細胞:LYZ和CST3(14656,15.9%),成纖維細胞:COL1A1和LUM(3764,4%),上皮細胞:KRT19和UPK1B(1096,1.19%),NK細胞:CD56/NCAM1、CD16/ FCGR3A、NKG7(864,0.94%)和內皮細胞:CD31/ PECAM1(366,0.39%)(圖1e-h)。
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      圖1.scRNA-seq和空間轉錄組學的工作流程概述

      02  T細胞系和B細胞系的逐步聚類發現CD8+T細胞的功能障礙和B細胞的異常**
      為了表征IC組和對照組之間單個T細胞亞群的變化,作者對T細胞進行亞群化,并根據典型T細胞標記物的表達得到9個亞群,包括5簇CD4+ T細胞,3簇CD8+ T細胞簇和1簇NKT細胞(圖2a)。隨后分析了與細胞簇相關的基因表達情況(圖2b),此外,對T細胞亞群比例的分析顯示,IC膀胱中Treg細胞**增加,Th17細胞**減少(圖2c)。對IC組與對照組相比的差異表達基因(DEGs)進行了GO和KEGG的富集分析。結果發現Tregs的DEGs主要富集于mRNA分解代謝過程、病毒受體和局灶性粘附過程(圖2d),Th17細胞的DEGs主要富集于經典的炎癥信號通路中,如IL- 17信號通路和NF-kappa B信號通路(圖2e)。IC組中CD8+T細胞耗竭基因的表達水平相對高于對照組(圖2f-g),表明CD8+ T細胞在IC中存在功能障礙。同樣的,為了進一步研究B細胞亞群的轉錄變化,作者將B細胞亞群化,發現6個B細胞亞群(圖2h),如圖2i所示。對B細胞亞群比例的分析顯示,活化的B細胞和usmb**增加,smb和tbc**減少(圖2j)。IC組與對照組之間的衰老相關基因表達水平無**性差異(圖2k)。B細胞的異常**和漿細胞的鑒定暗示了IC患者體內可能發生體液免疫反應。隨后,作者對IC組和對照組患者的血漿和尿液中的IgA、IgM、IgG、IgG和IgE等免疫球蛋白進行鑒定。結果發現兩組患者血漿中所有的免疫球蛋白均無統計學差異,但IC患者尿液中IgE**升高(圖2l),表明IgE可能是IC的尿液生物標志物。
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      圖2.T細胞和B細胞的聚焦分析

      03  髓系細胞簇的分類和注釋揭示免疫相關的巨噬細胞
      作者描述了髓系細胞的分子和功能上的差異,并在髓系細胞簇中鑒定出了6種細胞亞型(圖3a)。對兩組細胞亞群比例的分析顯示,IC膀胱中髓系細胞多為中性粒細胞(51.20%),而不是肥大細胞(圖3b)。與對照組相比,IC組中性粒細胞中DEGs的KEGG分析顯示,在抗原加工和呈遞以及類風濕關節炎通路中**富集(圖3c)。擬時序分析描述了從CD14+巨噬細胞到m2樣巨噬細胞的主流發育軌跡(圖3d-e)。在分化過程中,CD14+巨噬細胞中的促炎基因(IL-1β、S100A8和NLRP3)表達上調,但隨著時間的推移逐漸下調。同時,在m2樣巨噬細胞中,吞噬基因和調控受體(CD163、FOLR2、STAB1、C1QA1和MSR1)逐漸上調(圖3f)。與對照組相比,炎癥性CD14+巨噬細胞的功能與炎癥反應的產生有關,如IL-6的產生和NFkappa B信號通路的調控(圖3g)。然而,m2樣巨噬細胞主要通過MHCII類分子調節免疫(圖3h),其DEGs主要富集在自身免疫性疾病如多發性硬化癥和吉蘭-巴雷綜合征中。(圖3i)。此外,作者對CD68、S100A8和CD163進行了免疫熒光染色,來驗證CD14+巨噬細胞和m2樣巨噬細胞的存在(圖3j)。
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      圖3.髓系細胞的聚焦分析

      04  質譜流式檢測技術(CyTOF)驗證細胞的免疫表型異質性
      作者用CyTOF方法對IC患者膀胱內的免疫亞群進行了鑒定,并驗證了scRNA-seq結果(圖4a)。每個聚類中所選標記物的蛋白水平如圖4b所示,并且T-SNE圖確定了來自IC患者和對照組的40個集群(圖4b-c)。隨后捕獲CD45+免疫細胞,進行CyTOF分析(圖4d),并確定不同的細胞亞群,包括CD4+ T細胞(CD3+CD4+)、CD8+ T細胞(CD3+CD8+)、B細胞(CD19)、巨噬細胞(CD68)、DC細胞(CD11C)、肥大細胞(KIT)和活化細胞(HLA-DR),推測細胞類型與scRNA-seq結果一致(圖4e)。與基于scRNA-seq的集群定義一起,這些數據幫助驗證和建立了IC膀胱中的細胞免疫細胞圖譜。
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      圖4.CyTOF驗證IC膀胱中免疫細胞的表型異質性

      05  IC的免疫**網絡
      為了確定IC組中細胞**之間的潛在相互作用,作者分析了相應的受體和配體(**趨化因子、細胞因子及其受體)的表達模式。相互作用的受體和配體主要分布在內皮細胞、巨噬細胞、cDCs和CD4+ Tem的表面(圖5a)。IC組前50對相互作用的免疫**網絡如圖5b所示。CX3CL1主要在上皮細胞中表達,而上皮細胞的受體(CX3CR1)在幾個下游細胞亞群中表達上調。作者發現兩種趨化因子受體(FGFR1和FGFR2)在幾乎所有的細胞亞群中都有表達,但它們的配體(FGF2和FGF10)主要在成纖維細胞中表達(圖 5c)。這些發現表明上皮細胞和成纖維細胞可能協調IC膀胱中免疫細胞的轉移。炎癥因子(TNF、IFNG和IL-1β)的高表達也表明在IC膀胱中有強烈的炎癥反應(圖 5d),此外,一種新發現的趨化因子CCL5在幾乎所有類型的細胞中都表達上調。ELISA檢測表明尿液中CCL5水平較高,但在血液中沒有發現(圖5e),這使CCL5成為IC的潛在尿液生物標志物。研究還發現,Treg中IL-10和IL-35的表達降低(圖5f),而TGF-β信號通路的表達上調(圖5g),表明IC膀胱中Treg存在功能障礙。除參與免疫應答外,IC患者上皮細胞的DEGs在人**瘤病毒**和與病毒蛋白相互作用的細胞因子和細胞因子受體中富集(圖5h),在成纖維細胞的富集分析中也得到了類似的結果(圖5i)。隨后,作者預測了IC膀胱中上皮細胞的前5個轉錄因子,包括NR2F1、FOXA1、HOXD1、TBX2和OVOL1(圖5j),而NR2F1與HIV**相關。此外,研究還發現Treg、Th17、Act Bs、SMBs、USMBs和中性粒細胞都與病毒**相關(圖5k)。綜上所述,作者推斷病毒**可能是導致IC的潛在原因之一。人多瘤病毒-2在IC尿液中檢測到的陽性率為95%(19/20),但在對照組的尿液中沒有發現(圖5l),該結果也為IC的病因學和病理生理機制提供新的線索和理論依據。
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      圖5.基于scRNA-seq的cellphone DB分析揭示免疫網絡中的串擾現象

      06  空間轉錄組學(ST)證明了IC尿路上皮中免疫細胞的聚集
      將來自IC組和對照組的6個膀胱組織樣本放置在空間條形碼的ST微陣列玻片上(圖1a),經H&E染色和亮場成像后,切片觀察明顯的組織學特征。從IC膀胱的第一張ST圖上(圖6a),作者觀察到這些基因與UMIs之間有很強的相關性(圖6b)。并且作者從平滑肌細胞(SMCs)(DES、ACTG2和CNN1)、尿路上皮細胞(KRT19)、肌成纖維細胞(ACTA2)、間質細胞(ISCs)(VIM和KRT13)和肥大細胞(KIT)上檢測到了標記基因(圖6c)。此外,作者還描述了膀胱壁的完整結構,包括尿路上皮區、固有層和肌肉層(圖6d)。而纖維化基因在不同細胞類型中高表達,表明膀胱結構可能發生了嚴重的纖維化(圖6e)。圖6g是對照組膀胱的第一張ST圖。這些基因與UMIs之間的相關系數為0.98(圖6h)。隨后,作者從對照組膀胱組織中鑒定出了SMCs、ISCs、成纖維細胞(COL1A2)、肌成纖維細胞和尿路上皮細胞(圖6i-j)。發現在對照組的細胞中,纖維化基因的表達水平較低(圖6k)。為了確定免疫細胞在IC膀胱中的位置,作者用MIA方法來解釋跨組織之間的空間限制性映射,結果發現幾乎所有的免疫亞群均在尿路上皮區或IC膀胱成纖維細胞附近富集(圖6f),在對照組膀胱的尿路上皮和平滑肌細胞周圍富集(圖6l),證實了上皮細胞和成纖維細胞在IC的發展中的重要作用。
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      圖6.使用多模態交叉分析(MIA)繪制IC膀胱切片上不同的免疫群體

      小   結

      本文聯合scRNA-seq空間轉錄組學技術對間質性膀胱炎免疫圖譜進行分析,確認了這些免疫細胞亞群的特征,并闡述了它們之間的關系和相互作用。在IC膀胱和對照組膀胱中觀察到不同的免疫細胞分布,暗示尿路上皮可能在IC的病因和進展中起著重要作用。尿路上皮層的損傷可導致其滲漏和通透性的增加,是膀胱疾病病理生理學的關鍵因素。該研究構建的免疫圖譜可能為IC的病理生理學提供一定的支持,并為未來該疾病的診斷和**奠定基礎。


      云序生物單細胞測序和空間轉錄組學介紹

      云序生物推出單細胞測序和空間轉錄組學技術服務,助力您更好地了解生物學過程和疾病的空間定位。

      單細胞測序技術亮點優勢:
      1)一次性獲得上萬個細胞的高通量單細胞測序數據
      2)多細胞比例低至 0.8%/1000 個細胞
      3)單個樣品可同時檢測免疫細胞表面蛋白編碼序列與轉錄組信息
      4)細胞表面蛋白與基因表達聯合分析可對細胞亞群精細分類


      單細胞測序技術原理:
      云序生物提供的單細胞測序技術采用微流控技術,將單個細胞包裹在含有磁珠的油滴內,通過磁珠上的單細胞 barcode 實現對每個細胞來源核酸的溯源。
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      單細胞測序樣本要求:
      (1)單細胞測序:
      組織樣品>0.2g,2-8℃ 組織保存液(Miltenyi,貨號:130-100-008)運輸,36 小時內送達云序生物實驗室。
      血液樣品 2-5mL,2-8℃ EDTA 抗凝管運輸,4 小時內送達云序生物實驗室。
      單細胞懸液,要求細胞量>106個,使用不含二價金屬離子和 EDTA 的緩沖體系,2-8℃ 條件下 2 小時內送達云序生物實驗室。
      注:單細胞測序細胞直徑建議小于30μm,切勿超過40μm
      由于單細胞測序對采樣和運輸的要求非常嚴苛,請您在采樣前與云序生物的銷售部門確認送樣方式,溝通確認組織保存液/**管/細胞緩沖液的詳細信息,填寫《單細胞實驗預約單》,并在規定的時間內盡快將樣品送至云序生物實驗室。
      (2)單細胞核測序:
      組織>0.2g,細胞>106個。
      組織液氮速凍,細胞沉淀-80℃保存,干冰包裹運輸。


      空間轉錄組學技術亮點優勢:
      1)通過分析同一組織切片的組織學特征和mRNA空間表達情況,可以發現新的組織生物標志物。
      2)通過轉錄組分析,可以揭示新發現的細胞流行、細胞狀態和生物標志物的空間排布。
      3)通過于預先設計的靶基因組合,可以驗證之前發現的結果,或關注所有與靶基因相關的基因。
      4)闡明生物學結構,并了解正常組織和病理組織中細胞之間的空間關系。
      5)分析并了解基因表達的空間異質性,等等。


      空間轉錄組學測序技術原理:
      在云序生物提供的空間轉錄組技術服務當中,透化和雜交步驟發生于玻片上的平面捕獲區域,其中含有數千個圓點(spot)。在每個圓點中,玻璃基底上覆蓋了數以百萬計的寡核苷酸序列。這些附著在玻璃基底表面上的寡核苷酸序列末端存在 poly(dT)VN 結構,可以有效捕獲含有 poly(A) 尾巴的 mRNA。不同的圓點中的寡核苷酸序列則擁有不同的“條形碼”(Barcode)序列,以形成****的位置定位信息。根據這些空間條形碼序列,我們可以將 mRNA 測序結果回溯定位到特定的圓點坐標上,從而實現對 mRNA 表達譜信息的準確空間定位。

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      空間轉錄組學測序技術步驟:
      1.組織切片,獲得約 10 um 厚度的切片
      2.傳統方法染色成像,如 H&E 染色和免疫熒光染色
      3.組織透化(Permeabilization),以從細胞中釋放 mRNA
      4.雜交,以形成位置信息定位
      5.建庫和測序
      6.數據分析和可視化

      空間轉錄組學測序技術樣本要求:
      新鮮冷凍組織(包埋冷凍同時進行)
      1)樣品份數:對于同一來源的樣品,云序生物建議寄送2份,其中一份用于常規 RNA 提取質檢和實際的空間轉錄組實驗,一份留作備用。
      2)樣品量:每份樣品須小于 6.5mm x 6.5mm x 6.5mm,相當于大約一顆綠豆大小。請勿提供過大或過小的樣品,因為樣品過大將造成制片困難,無法在單一矩形捕獲區域中涵蓋整個樣品切片;樣品過小將造成捕獲區域的浪費,且可能導致常規 RNA 質檢用量不足。
      3)樣品保存和運輸:因新鮮組織運送要求高,建議客戶做到冷凍組織-OCT 包埋后干冰運輸送樣。

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      上海云序生物科技有限公司
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