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      1區,IF=19.16| 云序RNA乙?;瘻y序acRIP-seq助力病毒復制機制研究!
      日期:2022年09月01日    來源:
      N4-乙酰胞苷(ac4C)對mRNA的翻譯和穩定性至關重要。雖然在RNA病毒中發現了ac4C,但ac4C影響病毒復制的詳細機制尚不清楚。2022年8月16日,云序客戶中國科學院武漢病毒所與深圳大學的研究者們在Nucleic Acids Research(IF=19.16)雜志上發表了文章“N4-acetylcytidine regulates the replication and pathogenicity of enterovirus 71”。本文報道了腸道病毒71(EV71)基因組的5’UTR區存在由宿主乙酰轉移酶NAT10催化產生的ac4C修飾。而且,ac4C通過選擇性招募PCBP2到IRES來增強病毒RNA的翻譯,并提高了RNA的穩定性。此外,抑制NAT10和突變ac4C位點抑制了EV71的復制,且ac4c缺陷突變體EV71在小鼠體內表現出的致病性降低。此項研究結果突出說明了ac4C在EV71**中的重要作用,并為潛在的抗病毒治療提供了新的見解。云序生物有幸參與了此項研究中的ac4C acRIP-seq高通量技術服務。 
      至此我司已經為合作客戶發在Nucleic Acids Research(IF=19.16)、Journal of Hematology & Oncology (IF=23.168)、Advanced Science雜志(IF=17.52)等核心期刊中均提供過ac4C acRIP-seq高通量技術服務以及生信分析。

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      發表期刊:Nucleic Acids Research
      影響因子:19.160
      發表時間:2022年8月16日
      研究方法ac4C acRIP-seq、acRIP-qPCR、RIP-qPCR
      文章鏈接N4-acetylcytidine regulates the replication and pathogenicity of enterovirus 71
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      技術路線

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      研究內容

      01  EV71 RNA的5’ UTR中含有ac4C修飾,且宿主NAT10表達模式發生改變
      為了研究EV71 RNA是否含有ac4C修飾,作者大規模純化EV71 RNA,并通過UPLC-MS/MS進行定量,發現病毒粒子的EV71 RNA中ac4C殘基占總胞苷的0.201%。此外,針對EV71基因組RNA進行acRIP-qPCR分析,發現來自病毒**細胞和病毒粒子的EV71 RNA都被拉下,而在體外轉錄的病毒基因組沒有被拉下。為了繪制EV71基因組中的ac4C修飾譜,作者進行了ac4C acRIP-seq分析。在EV71基因組的311到406核苷酸(nt)區域發現了一個明顯的ac4C峰,該峰位于5’ UTR區IRES內的莖環IV(nt 242-445)。EV71不編碼任何具有乙酰轉移酶活性的蛋白。為了研究EV71 RNA上的ac4C修飾是否被細胞乙酰轉移酶NAT10催化,作者進行了RIP-qPCR實驗,結果表明NAT10與EV71 RNA相互作用。此外,過表達或敲低NAT10時,病毒RNA上的ac4C的強度相應增加或降低。綜上所述,EV71 RNA上含有ac4C修飾,且由宿主乙酰轉移酶NAT10介導。EV71在細胞質中進行復制,而NAT10主要分布在細胞核中,而免疫熒光顯示,在EV71存在的情況下,NAT10同時定位于細胞核和細胞質,表明EV71**改變了NAT10的亞細胞定位。此外,在病毒**過程中檢測到較強的NAT10信號,提示EV71**可能增強了NAT10的表達。
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      圖1. EV71含有ac4C修飾,并改變了NAT10的表達模式


      02  5’ UTR區的ac4C修飾促進了EV71的復制
      為了研究ac4C是否影響EV71的復制,作者構建了NAT10敲低Vero細胞并**EV71,發現EV71滴度和RNA拷貝數均**降低,暗示NAT10促進了病毒的復制。NAT10作用于共識基序5’-CCG-3’,促進中心胞苷的乙?;?。作者為了評估EV71 5’ UTR上的ac4C峰中的兩個5’-CCG-3’基序是否被ac4C修飾,構建了EV71 cDNA全長克隆的突變體Mut-331、Mut-350、Mut-331-350以及對照Mut-383。acRIP-qPCR結果顯示,與WT EV71相比,ac4C突變病毒粒子和突變病毒**細胞的EV71 RNA中的ac4C豐度均**降低,表明這些C殘基在EV71基因組中發生乙?;?。且當ac4C位點發生突變時,子代病毒滴度和基因組RNA拷貝數均**下降,而在shRNA介導的NAT10敲除的細胞中,WT和突變病毒的子代病毒滴度沒有差異。這些結果支持了ac4C在EV71復制中起著重要作用。在EV71復制過程中存在正鏈和負鏈RNA,與負鏈RNA相比,下調NAT10更**地降低了病毒正鏈RNA的水平,表明NAT10主要影響病毒正鏈RNA。
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      圖2. ac4C修飾促進了EV71的復制



      03  ac4C修飾通過增強PCBP2與IRES的結合來促進RNA的翻譯
      EV71 RNA的乙?;稽c位于IRES的莖環IV(nt242-445),對病毒蛋白合成至關重要,因此,ac4C修飾可能影響EV71 RNA的翻譯效率。作者用蔗糖密度梯度離心和qRT-PCR檢測了在有無NAT10存在的情況下,核糖體對病毒RNA的裝載效率。值得注意的是,shRNA介導的NAT10敲除**抑制了EV71 RNA上的核糖體裝載,表明ac4C增強了EV71 RNA的翻譯。作者構建了插入EV71 WT或ac4C突變體的5’ UTR區的eGFP報告質粒,并將其轉染到RD細胞中,發現EV71 ac4C突變體轉染細胞中eGFP的表達減少,進一步表明ac4C提高了EV71 RNA的翻譯效率。體外翻譯實驗同樣證實了ac4C促進了EV71 RNA的翻譯。接下來,作者通過RIP-qPCR研究了EV71 WT或ac4C突變體IRES與PCBP2和HNRNPK的結合能力,結果表明,ac4C通過選擇性地增強PCBP2與IRES的結合來促進病毒的翻譯。
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      圖3. ac4C提高了EV71 RNA的翻譯效率

      04  ac4C修飾提高了EV71 RNA的穩定性
      mRNA的翻譯效率和穩定性有著錯綜復雜的聯系,mRNA翻譯的減少降低了mRNA的穩定性,反過來降低了翻譯效率。為了探討ac4C修飾是否與EV71 RNA的穩定性有關,作者構建了EV71 WT和ac4C突變體的3D移碼突變質粒,并將其轉染到Vero細胞中,在不同時間點進行qRT-PCR分析。結果顯示,與WT病毒相比,ac4C突變體的RNA降解速度加快。然而,當使用重構蛋白抑制NAT10的功能時,WT病毒和突變病毒之間的RNA降解率沒有**差異。以上結果表明,ac4C修飾影響了RNA的降解效率。值得注意的是,在ac4C修飾的情況下,WT-mut3D和Mut-331-350-mut3D的RNA穩定性都增加了,表明ac4C增強了EV71 RNA的穩定性。接下來,作者探討了病毒RNA翻譯對RNA穩定性的影響。當使用環己酰亞胺處理細胞抑制翻譯時,WT-3Dmut RNA的降解加速,而ac4C突變體RNA的降解速率沒有明顯變化。值得注意的是,PCBP2的敲除導致了病毒RNA的加速降解。這些結果表明,ac4C對EV71 RNA穩定性的影響與病毒RNA的翻譯效率有關。
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      圖4. ac4C增強了EV71 RNA的穩定性


      05  ac4C在體內和體外均促進了EV71 RNA與3D的結合

      3D是在EV71復制過程中直接結合并合成病毒RNA的關鍵蛋白。由于乙?;龠M了PCBP2與EV71 RNA的結合,作者接下來評估了ac4C是否影響了3D與病毒RNA的結合。作者通過RIP-qPCR分析與3D結合的RNA,發現3D結合的EV71 RNA通過重構蛋白處理抑制NAT10而減少,表明ac4C修飾影響了病毒RNA與3D的結合。然而,當ac4C突變體病毒與重構蛋白一起培養時,3D結合的RNA并沒有明顯的變化。這些數據表明,ac4C修飾促進了EV71 RNA與3D的結合。為了探索ac4C修飾是否影響3D與病毒基因組的結合,作者進行了3D體外結合試驗實驗,結果不僅表明ac4C在體外增強了3D結合,而且表明乙?;稽c的位置對其結合能力具有重要作用。
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      圖5. ac4C促進了EV71 RNA與3D的結合
      06  EV71 ac4C突變病毒在小鼠體內的致病性降低
      為了研究乙?;欠裼绊懥瞬《镜闹虏⌒?,作者用EV71 WT或Mut-331-350**AG6干擾素受體缺陷小鼠。與**WT病毒的小鼠相比,**ac4C突變病毒的小鼠顯示出更長的存活時間和更慢的體重減輕,且在**WT病毒的小鼠中觀察到更嚴重的肢體癱瘓。此外,qRT-PCR分析顯示,**Mut-331-350病毒的小鼠,所有檢測**的肌肉、腸、腦、心、肝、肝、脾、肺和腎中的病毒RNA水平均**降低。在mut-331-350**小鼠的肢體肌肉、大腦和腸道中觀察到致病性降低,導致肌纖維壞死和神經元損傷減少,腸細胞增生、腸絨毛上皮細胞溶解、絨毛頂端細胞空泡化減少。綜上所述,這些結果表明EV71 ac4C突變減少了小鼠的病理損傷。
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      圖6. ac4C突變病毒在小鼠中表現出致病性降低
      小  結
      本文運用ac4C acRIP-seq測序技術鑒定到腸道病毒EV71基因組的5’ UTR區IRES內存在ac4C修飾,且由宿主乙酰轉移酶NAT10催化產生。該ac4C修飾通過增強PCBP2與IRES的結合來增強病毒RNA的翻譯,并提高了RNA的穩定性。此外,抑制NAT10或突變ac4C位點抑制了EV71的復制,且ac4c缺陷突變體EV71在小鼠體內表現出致病性降低。該研究突出說明了ac4C在EV71**中的重要作用,并為潛在的抗病毒治療提供了新的方向。

      云序生物ac4C修飾研究五大模塊

      01 ac4C RNA修飾測序
      ac4C RNA修飾測序
      對ac4C RNA乙?;?,目前***的檢測手段為acRIP-seq技術,適用于ac4C RNA乙?;V研究,快速篩選ac4C RNA乙?;谢?。云序可提供mRNA和多種非編碼RNA的ac4C測序:
      • ac4C 全轉錄組測序(涵蓋mRNA,LncRNA,circRNA)
      • ac4C  LncRNA測序(涵蓋LncRNA和mRNA)
      • ac4C  Pri-miRNA測序(涵蓋Pri-miRNA和mRNA)
      • ac4C  mRNA測序
      • ac4C  rRNA測序
      • ac4C  circRNA測序
      • ac4C  tRNA測序

      02 檢測整體ac4C RNA修飾水平
      LC-MS/MS檢測整體RNA修飾水平
      **高效,可以實現一次檢測,9類修飾水平檢測,一步到位。

      03 ac4C RNA修飾上游酶的篩選
      ac4C RNA修飾相關酶PCR芯片
      尋找上游直接調控ac4C RNA乙?;募谆D移酶。

      04 ac4C RNA修飾靶基因驗證
      acRIP-qPCR
      云序提供acRIP-qPCR服務,可針對mRNA,lncRNA,環狀RNA等不同類型的RNA分子進行檢測,低通量驗證靶基因RNA修飾水平。


      05 機制互作研究

      RIP-seq/qPCR
      篩選或驗證RNA修飾直接靶點,研究RNA修飾靶基因的調控機制。
      RNA pull down -MS/WB
      篩選或驗證目標RNA互作基因或蛋白,研究相應的分子調控機制。
      雙熒光素酶實驗
      驗證兩基因互作,研究相應的分子調控機制。
      ChIP-seq
      篩選或驗證目標蛋白與DNA互作,研究相應的分子調控機制。

      --  云序生物服務優勢  --

      優勢一:云序累計支持客戶發表  84  +篇RNA修飾SCI論文,合計影響因子 814  +,其中RNA乙?;瘻y序高達3篇論文IF接近20。

      優勢二累計完成數千例 RNA甲基化測序樣本,**覆蓋醫口、農口等各類樣本。

      優勢三:**檢測mRNA和各類非編碼RNA(circRNA,lncRNA,Pri-miRNA等)。

      優勢四:**提供ac4C一站式服務:ac4C整體水平檢測、acRIP-seq、acRIP-qPCR驗證、RIPRNA pull down等。

      優勢五:率先研發微量acRIP測序技術,RNA量低至500ng起。

      優勢六:國內*全的RNA修飾測序平臺,提供m6A、m5C、m1A、m7G、m3C、m6Am、O8G、ac4C乙?;?'-O-甲基化測序。


      云序客戶多種RNA修飾(m6A以外修飾)部分文章列表


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      云序客戶m6A修飾部分文章列表


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